渐渐习惯了现代生活的美国队长（克里斯·埃文斯饰），在一次行动后隐隐嗅到神盾局内部所弥漫出来的凶险气息而当得知神盾局正秘密进行的“洞察计划”后，他更为此感到愤怒某天，神盾局指挥官尼克·法瑞（塞缪尔·杰克逊饰）遭到一群武装分子袭击，他拼尽全力将一支U盘交到美国队长手中，这里面藏着神盾局二战以来最重要且最可怕的秘密。在此之后，美国队长因涉嫌杀害尼克·法瑞而遭到前局长亚历山大·皮尔斯（罗伯特·雷德福饰）的通缉和追杀，逃亡中他得到黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊饰）和退伍老兵“猎鹰”山姆（安东尼·麦凯饰）的帮助。他们必须争分夺秒解开神盾局的秘密，阻止“洞察计划”的实施。